заказ пустой
скидки от количества!0Г1АВ1ЕНИЕ
1. ВЕВДЕНИЕ
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
2.1. Роль глутамина в азотном обмене и его ферментативное дезамидирование
2.2. Распространенность глутаминазы и ее локализация
в тканях и клетках
2.3. -Субстратная специфичность
2.4. Кинетика действия глутаминаз
2.5. Механизм катализа ферментативного гидролиза глутамина
2.6. Механизмы регуляции глутаминазы
2.6.1. Влияние реактивов на сульфгидрильные группы
2.6.2. Влияние структурных аналогов глутамина
2.6.3. Влияние различных ионов
2.6.4. Влияние нуклеозидмоно-, -ди-, -трифосфатов я
органических кислот
2.7. Активность глутаминазы на различных стадиях
роста микроорганизмов и изо энзимы глутаминазы
2.8. Очистка глутаминаз
2.9. Физиологическая роль глутаминазы микроорганизмов
3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ПАСТЬ
3.1. Объект исследования и характеристика
использованных реактивов
3.2. Методы исследования
3.2.1. Получение дрожжевого экстракта
3.2.2. Фракционированное осаждение белков сульфатом аммония
3.2.3. Разделение белков гель-фильтрацией через
Сефадекс
3.2.4. Разделение белков на КМ-целлюлозе
3.2.5. Диск-электрофорез в полиакриламидном геле
3.2.6. Разработанная модификация метода определения активности глутаминазы
3.2.7. Определение белка по методу Лоури
3.2.8. Определение молекулярной массы глутаминазы
с помощью гель-хроматографии
3.3. Полученные результаты и их обсуждение
3.3.1. Исследование активности глутаминазы при разных режимах хранения дрожжевого экстракта
3.3.2. Выделение и очистка глутаминазы из пекарских
дрожжей
3.3.3. Кинетические свойства глутаминазы в реакции дезамидирования глутамина
3.3.3.1. Изучение реакций дезамидирования глутамина
во времени
3.3.3.2. Зависимость активности глутаминазы от темпе -ратуры
3.3.3.3. Влияние pH на активность глутаминазы
3.3.3.4. Зависимость активности фермента от концентрации глутамина
3.3.3.5. Влияние концентрации ферментного препарата
на активность глутаминазы
3.3.3.6. Термостабильность фермента
3.3.4, Исследование регуляции глутаминазы дрожжей
3.3.4.1. Влияние фосфата и пирувата на активность
фермента
3.3.4.2. Влияние парахлормеркурибензоата на активность фермента
3.3.4.3. Влияние ЭДТА и ионов металлов на активность глутаминазы
3.3.4.4. Влияние некоторых органических кислот на активность фермента
3.3.4.5. Влияние аминокислот на активность фермента
3.3.4.6. Влияние рибофлавина на активность фермента
3.3.4.7. Действие НАД и НАДФ на активность глутаминазы
3.3.4.8. Действие нуклеозидмоно-, -ди-, -трифосфатов
на активность глутаминазы
3.3.5. Определение молекулярной массы глутаминазы
пекарских дрожжей
4. ЗАКЛКЛБШЕ
5. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
методов наш была разработана методика определения, активности дрожжевой глутаниназы. Из метода Детрунь и Мигаль мы заимствовали состав реакционной смеси и способ остановки реакции, а из метода Любимова и Львова - принцип определения выделяемого аммиака, по количеству которого мы и судили об активности глушаминазы*
В процессе работы над созданием модификации метода ш внесли некоторые конструктивные изменения в форму склянок для определения аммиака, предложенных в работе Любимова-я Львова,
Состав реакционной смеси < общий объем 2,9 ш):
1) 2,2 мл 0,05 М буфера трис-НС1 с pH 8,5
или _
2,2 мл 0,05 М буфера трис-НС1 »содержащего различные вещества »добавляемые для изучения регуляторных свойств фермента ( pH доводили до 8,5 0,5 Н раствором ИаОН);
2) 0,6 мл ферментативной вытяжки с pH 8,5 ;
3) 0,1 мл 0,2М свежеприготовленного раствора глутамина
Ход определения
Все компоненты реакционной смеси заливают в сосуд,изображенный ва рисунке 2 , и быстро закрывают притертой пробкой
со стеклянной палочной, которая заканчивается тарелочкой,протравленной плавиковой кислотой. В тарелочку предварительно наливают .2-3 капли 0,1Н раствора серной кислоты .Сосуд помещают в водняную баню на 60 мин. при температуре 48°. Реакцию останавливают добавлением 0,4 мл 30%-ной хлорной кислоты, вводимой через боковой отвод. Таким же способом для диффузии аммиака в реакционную смесь добавляют 3,3 мл насыщенного раствора К2СО3.