заказ пустой
скидки от количества!I. В В Е Д Е Н И Е
П. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1. Структура и функция бактериальных жгутиков
а) Базальное тело
б) Нить бактериального жгутика
в) Крючок
2. Регуляция образования и санкционирования бактериального жгутика
Ш. М А Т Е Р И А Л Ы И МЕТОДЫ
1. Получение бактериальной массы
а) Использованные штаммы микроорганизмов
б) Выделение подвижных форм бактерий
в) Получение биомассы Escherichia- coii MS 1550 43
г) Получение биомассы Bacillus brevis v&r. G.-В. P* 43
д) Выращивание Baciiius subtl/is 1GX
2. Выделение и очистка бактериальных жгутиков
а) Выделение интактных жгутиков E.coii
б) Выделение интактных жгутиков Ь. brevis
в) Выделение нитей бактериальных. га^йШов
г) Очистка бактериальных жгутиков 47
3. Получение мономерного фяагеллина
4. Получение миозина
5. Выделение субфрагмента I миозина
6. Получение изолированных хвостов миозина
7. Определение концентрации белка
8. Определение АТФазной активности миозина
9. Определение неорганического ортофосфата
10. Диск-электрофорез в полиакриламидном геле
11. Соосаждение нитей бактериальных жгутиков и флагеллина с миозином и изолированными хвостами миозина 53
12. Определение количества соосажденного белка
'13. Электронномикроскопические исследования
14. Сравнение первичной структуры флагеллина и актина 54
1У. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
1. Изучение структурной .организации жгутиков 3. brevis v<tr.G.-£.P + и E.cofi Mb 1350
2. Электронномикроскопическое изучение взаимодействия бактериальных жгутиков с субфрагментом I миозина 70
3. Взаимодействие нитей бактериальных жгутиков с миозином
а) Соосаддение нитей бактериальных жгутиков и флагеллина с миозином и изолированными хвостами
миозина
б) Влияние нитей бактериальных жгутиков на АТФазную активность миозина
в) Влияние нитей бактериальных жгутиков на взаимодействие миозина с актином
4. Возможные причины взаимодействия нитей бактериальных жгутиков с миозином
У. ЗАКЛЮЧЕНИЕ
У1. В Ы В 0 Д Ы
УП. Список литературы
I. ВВЕДЕНИЕ
В настоящее время известны несколько систем биологической подвижности, отличающихся как по молекулярной организации, так и по механизму функционирования. Среди них наиболее изученной является актомиозиновая система, лежащая в основе мышечного сокращения и большинства явлений немышечной подвижности. Молекулярный механизм функционирования этой системы основывается на взаимодействии как минимум двух белков. Один из них обладает АТФазной активностью (миозин), а другой (актин) образует структуры (нити Ф-актина) в значительной степени определяющие как организацию всей системы, так и ту форму подвижности (продольное скольжение), которую данная система осуществляет.
Совершенно иное положение обнаруживается при рассмотрении системы жгутиковой подвижности бактерий. Бактериальный жгутик представляет собой сложную структуру, состоящую из нити, крючка и базального тела. Нить находится снаружи клетки и при перемещении бактерий совершает винтообразные движения, которые обусловлены вращением базального тела жгутика, расположенного в толще клеточной стенки (41). Известно, что бактериальный жгутик включает в себя как минимум 13 полипептидов, организованных в структурные компоненты жгутика (77). Рядом авторов были проведены исследования с целью поиска в составе бактериальных жгутиков белков, обладающих АТФазной активностью. Было показано, что нить жгутика, состоящая из молекул единственного белка флагеллина такой способностью не обладает (39). В составе комплекса крючок-базальное тело также не обнаружено белков с АТФазной активностью (55). Таким образом, бактериальные жгутики отличаются от актомиозинового комплекса не только структурной организацией, но и способом энергообеспечения. Энергия для вращения бактериального жгутика постав-
7. Определение концентрации белка Концентрацию белка (флагеллина) определяли по методу Лоури (118), с модификацией, описанной Бейли (I). Калибровочную кривую строили по очищенному и лиофильно высушенному флагеллину B.breris . Корреляцию калибровочной кривой проводили путем определения белкового азота по Къельдалю.
Концентрацию белка для миозина и его фрагментов измеряли спектрофотометрически, используя следующие коэффициенты молярной экстищии при Е280нм : для миозина 5,6 см“^(156), для ЭДТА-CI -8,1 см-1(125) и для "СЧМ" - 3,5 см-1 (169).
8. Определение АТФазной активности
АТФазную активность миозина определяли по выделению неорганического ортофосфата. Инкубационная смесь содержала I мМ АТФ,
25 мМ трис-НС1 (pH 7,5), 50 мМ KCI, миозин (0,1-0,2 глг/мл) Са2+-АТФазную активность определяли в присутствии 5 мМ СаС12 в течение 5 минут. К^-ЭДТА-АТФазную активность определяли в присутствии 0,5 М KCI, 5 мМ ЭДТА в течение 10 минут. Активируемую актином Mg-АТФазную активность миозина определяли в присутствии Ф-актина (0,2-0,4 мг/мл), 5 мМ МдСТг в течение 20 минут.
Реакцию останавливали добавлением 2,1% НСТО^, осадок удаляли центрифугированием при 5 тыс. g 15 минут и в супернатанте определяли содержание неорганического ортофосфата (Фн). Удельную АТФазную активность выражали в мкмолях Фн/мин на мг белка, из расчета, что ОД мк моль Фн дает -значение при 860 нм равное 0,5.
9. Определение неорганического ортофосфата (135)
К 0,5 мл пробы, содержащей неорганический ортофосфат, добавляли 1,25 мл 1,1% хлорной кислоты для остановки реакции, 1,25 мл натрий-ацетатного буфера (pH 4,0) с 0,5%-м сульфатом меди, 0,5 мл