заказ пустой
скидки от количества!СОКРАЩЕНИЯ
1. ВВЕДЕНИЕ
1.1 Антибиотики и возникновение резистентности
1.2 Общее об антибиотиках
1.2.1 Воздействие антибиотиков на бактерии
1.2.2 Перзистентность
1.2.3 Общая устойчивость к антибиотикам
1.2.3.1 Механизмы устойчивости
1.3 Бета-лактамные антибиотики
1.3.1 Действие бета-лактамных антибиотиков
1.3.2 Клеточная стенка стафилококков
1.3.2.1 Строение клеточной стенки
1.3.2.2 Биосинтез клеточной стенки
1.3.3 Мишени бета-лактамов
1.3.4 Резистентность по отношению к бета-лактамным антибиотикам
1.3.4.1 Бета-лактамазы
1.3.5 Толерантность по отношению к бета-лактамным антибиотикам
1.4 Стафилококки и резистентность к бета-лактамам
1.4.1 Бета-лактамазы Staphylococcus aureus
1.4.2 Чувствительные к бета-лактамам СПБ
Staphylococcus aureus
1.4.2.1 Селективное ингибирование отдельных СПБ
1.4.3 Функции стафилококковых СПБ в биосинтезе клеточной стенки
1.4.4 Бактериолизис у стафилококков
1.4.5 Устойчивость к метицштлину
1.4.5.1 Еомогенная и гетерогенная /лес-резистентность
1.4.5.2 Влияние бета-лактамазы на устойчивость
к метициллину
1.4.5.3 Мес-детерминанта
1.4.5.4 Дополнительные факторы устойчивости
к метициллину
1.5 Исследование факторов резистентности посредством транспозонного мутагенеза
1.6 Постановка вопроса
2. Материалы и методы
2.1 Материалы
2.1.1 Антибиотики
2.1.2 Штаммы бактерий и плазмиды
2.1.3 Праймеры для секвенирования
2.1.4 Среды
2.1.5 Растворы
2.2 Методы
2.2.1 Культивирование и хранение бактерий
2.2.1.1 Получение ночной культуры (НК)
2.2.1.2 Хранение бактерий
2.2.2 Трансдукция
2.2.2.1 Получение лизата трансдуцируемых фагов
22.2.2 Получение трансдуктантов
2.2.3 Мутагенез посредством интеграции транспозона
2.2.4 Реплицирование на чашки
2.2.5 Фенотипические характеристики мутантов
2.2.5.1 Определение размера зоны ограниченного роста
2.2.5.2 Определение минимальной ингибирующей концентрации (МИК)
2.2.5.3 Градиентные чашки
2.2.5.4 Доказательство существования бета-лактамазы
(тест с нитроцефином)
2.2.6 Выделение ДНК
2.2.6.1 Хромосомная ДНК
2.2.6.1.1 Выделение хромосомной ДНК
2.2.6.1.2 Очистка ДНК. Фенольная экстракция
2.2.6.2 Выделение плазмидной ДНК
2.2.6.2.1 Минивыделение
2.2.6.2.2 Максивыделение
2.2.7 Разделение ДНК
2.2.7.1 Аналитический электрофорез в геле
2.2.7.2 " Пульс" электрофорез в геле (PFGE)
2.2.7.2.1 Приготовление проб для PFGE
2.2.1.2.2 Рестрикционная смесь для PFGE
2.2.1.2.3 Разделение проб
2.2.1.3 "Инверсированный" электрофорез в геле (FIGE)
2.2.8 Экстракция ДНК из геля
2.2.9 Гибридизация по Саузерну
2.2.9.1 Перенос ДНК
2.2.9.2 «Лифтинг» колоний и плаков
2.2.9.3 Мечение ДНК по методу " Random Primed "
2.2.9.4 Гибридизация
2.2.10 Клонирование
2.2.10.1 Дефосфорилирование вектора
2.2.10.2 Лигирование
2.2.10.3 Трансформации
2.2.10.3.1 Электротрансформация штамма Е.соИ ОНЮВ
2.2.10.3.1.1 Получение компетентных клеток
2.2.10.3.1.2 Электропорация
2.2.10.3.2 СаСЬ-трансформация штамма Е.соИ БНЮВ
2.2.10.3.2.1 Получение компетентных клеток
2.2.10.3.2.2 Трансформация
2.2.10.4 Определение положительных клонов
2.2.11 Дидеокси-ДНК-Секвенирование
2.2.11.1 Подготовка проб
2.2.11.1.1 Денатурация ДНК
2.2.11.1.2 Мечение
2.2.11.2 Подготовка гелей
2.2.12 Выделение СПБ
2.2.12.1 Мечение СПБ в клетках
2.2.12.2 Мечение СПБ в клеточных экстрактах
2.2.12.2.1 Получение фракции мембранных белков
2.2.12.2.2 Мечение экстракта протеина 3Н-пенициллином
2.2.12.3 БЭБ-полиакриламидный электрофорез в геле (БОБ-РАСЕ)
3. РЕЗУЛЬТАТЫ
3.1 Получение инсерционных мутантов с измененной устойчивостью к бета-лактамам
3.1.1 Схема эксперимента
3.1.2 Получение первичных мутантов
3.1.3 Идентификация мутантов
3.1.3.1 Определение минимальной ингибирующей концентрации для различных СПБ-блокирующих антибиотиков для штамма БС511
3.1.3.2 Селекция на редуцированную устойчивость
к бета-лактамам
3.1.3.3 Котранедукция фенотипа устойчивости
с транспозоном
3.1.3.4 Доказательство наличия транспозона посредством гибридизации
3.1.3.5 Выделение мембранных белков
3.2 Характеристика мутантов
3.2.1 Фенотипические характеристики
3.2.1.1 Трансдукция мутантов в штаммы с различным генетическим фоном
3.2.1.2 Определение резистентности
3.2.1.2.1 Измерение зоны ограниченного роста
субингибиторных концентрациях селективно связывают отдельные чувствительные к бета-лактамам СПБ. Ингибирование отдельного СПБ вышеупомянутыми бета-лактамами не оказывало никакого или имело только незначительный фенотипический эффект, зато одновременное ингибирование нескольких СПБ, в частности, в комбинации с СПБ1 вело, тем не менее, к ингибированию роста и соответственно к гибели клеток. При этом было неясно, будет ли инактивация СПБ-генов мутацией иметь тот же эффект, что и ингибирование бета-лактамами. Если это так, тогда мутации в СПБ-гене в сочетании с ингибированием соответствующим бета-лактамом должны были вести к ингибированию роста. Таким образом, при отборе в присутствии соответствующего бета-лактама могли бы быть идентифицированы СПБ-мутанты.
Кроме СПБ существуют дальнейшие факторы, занятые в развитии и экспрессии устойчивости к бета-лактамам. Только немногие из этих факторов уже картированы на хромосоме, о механизмах их действия известно немного. О факторах, которые регулируют устойчивость к метициллину, известно, что они непосредственно или косвенно задействованы в биосинтезе клеточной стенки. В этой связи интересен вопрос, можно ли найти другие механизмы и другие гены-мишени, которые определяют устойчивости к бета-лактамам.
Как описано в литературной части, при мутагенезе посредством инсерции транспозона был открыт ряд /ёт-факторов с важными функциями для тес-резистентности и для биосинтеза клеточной стенки. Преимущество этого метода заключается в том, что инактивируемый фактор может быть найден посредством локализации места инсерции. При этом до сих пор преимущественно использовался один генетический фон (штамма N0108325), и был проведен отбор полученных мутантов лишь на редукцию резистентности по отношению к Мес. В качестве транспозона использовался практически исключительно Тп55/. Исходя из всего сказанного, целью этой работы