Клеточные механизмы регенеративного потенциала мезенхимных стволовых клеток, роль семейства продукта гена ретинобластомы

  • автор:
  • специальность ВАК РФ: 03.03.04
  • научная степень: Докторская
  • год, место защиты: 2014, Санкт-Петербург
  • количество страниц: 289 с. : ил.
  • бесплатно скачать автореферат
  • стоимость: 240,00 руб.
  • нашли дешевле: сделаем скидку
  • формат: PDF + TXT (текстовый слой)
pdftxt

действует скидка от количества
2 диссертации по 223 руб.
3, 4 диссертации по 216 руб.
5, 6 диссертаций по 204 руб.
7 и более диссертаций по 192 руб.
Титульный лист Клеточные механизмы регенеративного потенциала мезенхимных стволовых клеток, роль семейства продукта гена ретинобластомы
Оглавление Клеточные механизмы регенеративного потенциала мезенхимных стволовых клеток, роль семейства продукта гена ретинобластомы
Содержание Клеточные механизмы регенеративного потенциала мезенхимных стволовых клеток, роль семейства продукта гена ретинобластомы
Вы всегда можете написать нам и мы предоставим оригиналы страниц диссертации для ознакомления

Содержание
Введение
Актуальность проблемы
Цель и задачи работы
Научная новизна полученных результатов
Теоретическое и практическое значение работы
Основные положения, выносимые на защиту
Апробация работы
Финансовая и некоммерческая поддержка работы
Структура и объем диссертации
1. Обзор литературы
1.1. Регенеративный потенциал мезенхимных стволовых клеток (МСК)
Феноменология, основные свойства и классификация СК, свойства МСК и их положение в иерархии СК; опухолевые СК
Методологические подходы к пониманию регуляции самоподдержания различных типов СК
Регуляция самоподдержания СК осуществляется в контексте клеточного цикла с помощью белков семейства рКЬ
Происхождение МСК и компоненты их регенеративного потенциала
Клоногенность и самоподдержание
Дифференцировка в мышечные клетки
Дифференцировка в жировые клетки
Пластичность
Продукция гуморальных факторов
Трансформация в культуре и туморогенность
Модели для изучения регенеративного потенциала МСК
1.2. Роль семейства рИЬ в регуляции функций СК
Общая и функциональная структура рКЬ
Структурное и функциональное родство между членами семейства рКЬ
Регуляция функций рКЬ и членов его семейства путем фосфорилирования
Эффекторные функции рКЬ — контроль транскрипции, регулируемой
белками семейства Е2К
Механизмы активной транскрипционной супрессии и модификации хроматина, опосредованные рКЬ
Роль рКЬ в индукции дифференцировки и активации транскрипции
рКЬ и рестрикционная точка а
рКЬ и опухолевый рост
Роль рКЪ в регуляции самоподдержания стволовых клеток
1.3. Сигнальный путь Уп1/р-катенин в регуляции функций МСК
Общая характеристика сигнального пути УРпІ/ф-катенин
Передача сигналов 1¥п1//3-катенин, структура ф-катенина
Р-катенин и кадхериновый адгезивный комплекс
Регуляция стабильности Р-катенина путём фосфорилирования
Регуляция транскрипции, опосредованная р-катенином
Функциональная активность факторов семейства ЬЕР/ТСР в отсутствие

сигналов 1Уп1//1-ка>псиин
Роль сигналов 1Уп1//3-катенин в регуляции функций ЭСК
Роль сигналов Пгп1/[1-катенин в регулягцш функций соматических СК и МСК
Сигнальный путь Рп1/[1-катепин и опухолевый рост
Взаимодействие между сигнальными путями рРЬ и )Уп1ф-катенин в регуляции функций СК
2. Материалы и методы исследования
2.1. Клеточные лшпш и культивирование клеток, получение
и характеристика клеточных культур
Стабильные клеточные тиши
Получение первичных культур МСК из костного мозга
трансгенных мышей СРР
Получение первичных культур МСК из сердца и мочевого пузыря мышей
Оценка пролиферативной активности, плотности насьицения,
кривых роста клеток и антипролиферативной активности рРЬ
Индукция жировой, костной, мышечная и уротелиапыюй дифференцирован
Разработка модели эпителиальной дифференцировки МСК
Индукция сигнального пути Уш/р-катенин
Оценка клоногенности и туморогенности МСК
Получение клеток опухолевых эксплантатов (КОЭ)
Синхронизация клеток в различных фазах клеточного цикла
и проточная цитометрия
2.2. Плазмиды, временная и стабильная трансфекция и клонирование клеток
Плазмиды, содержащие ген К В мыши
Плазмиды, содержащие гены р130, р-катенина, СРР, Е2Р, ИР, СОК),
Р-Са1, ИЕО и репортёрные конструкции, включающие сайты
связывания белков Е2/и Ееф/Тс/
Трансфекция с помощью липофектамина и клонирование клеток
Трансфекция путём образования калъций-фосфатных
преципитатов и электропорации
Фракционирование клеточных экстрактов
2.3. Оценка уровня и активности белков, взаимодействия белков с ДНК
Электрофорез белков в полиакриламидном геле
Иммуноблотчнг и иммунопреципитация
Иммунофлюоресцентное окрашивание
Иммуногистохимический анализ
2.4. Выявление генов, оценка их активности и взаимодействия с белками
Идентификация экзогенного КВ путём гибридизагрш по Саузерну
Получение и электрофорез РНК в денатурирующем геле
и её количественная оценка
Синтез кДНК на матрице РНК и амплификация фрагментов генов с помощью полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) 103 Соматический нокдаун VNT2 с помощью миРНК
Оценка транскрипционной активности генов с помощью
метода люциферазного репортера
Приготовление метафазпых хромосом
Метод сдвига электрофоретической подвижности в геле (ЕМКА)
2.5. Изучение регенеративного потенциала МСК на моделях ш мЬо

Модель восстановления ткани мочевого пузыря,
повреждённой криотравмой
Модель восстановления ткани лёгких, повреждённой эндотоксином
Внутрилегочное введение реагентов
Оценка избытка воды в легких
Получение бронхо-альвеолярного смыва и определение
в нём и плазме крови концентрации цитокинов
Гистохимическая и иммуногистохимическая окраска ткани лёгких
Определение числа нейтрофилов и миелопероксидазпой активности в БАС 110 Выделение РНК, ОТ-ПЦР для маркеров TLR-4, CD14, MD2 и
определение их продуктов с помощью иммуноблотинга
Распределение в организме мышей эндотоксина, меченного 5lCr
Связывание и включение в МСК и клетки RAW 264.
эндотоксина, меченного 51Cr
Кокультивирование стимулированных ЛПС
альвеолярных макрофагов с МСК
Модель восстановления ткани лёгких, повреждённой нафталином
Модель восстановления ткани лёгких после бактериального повреждения
2.6. Животные
2.7. Реактивы
2.8. Антитела
2.9. Нуклеотидные последовательности
2.10. Статистическая обработка результатов
3. Результаты
3.1. Характеристика маркерных и ростовых свойств первичных
культур МСК из различных тканей плодов и зрелых мышей
МСК костного мозга трансгенных мышей GFP
МСК мочевого пузыря плодов и зрелых мышей линии Balb/c
Сравнение свойств МСК из сердца и мочевого пузыря плодов мышей
3.2. Характеристика регенеративного потенциала МСК в ходе их
длительного пассирования в культуре
Морфологические свойства
Пролиферативная активность и клоиогенность
Маркерные, дифферепцировочные и адгезивные свойства
Кариологический анализ
Туморогеипость
Изменения продукции ß-катенина, Тс/3,4 и Gsk3ß в ядрах клеток
3.3. Разработка модели in vitro для оценки дифферепцировки МСК в эпителий 136 Параметры кокулътивирования МСК с клетками линии А-
легочного происхождения
Кокультивирование с клетками эпителиального происхождения
индуцирует в МСК экспрессию эпителиальных маркеров 13
Кокультивирование с клетками А-549 вызывает в МСК
индукцию сигнального пути Wnt/ß-катетш
Оценка уровней общеклеточного, фосфорилированиого по Ser33/37/Thr41 и дефосфорилированного по Ser37/Thr41 ß-катешш в МСК и клетках 293Т
Соматический нокдаун гена WNT2 в клетках А-549 тормозит индукцию сигналов Wnt/ß-катетш и эпителиальную

мезенхимных клетках трансгенных мышей in vivo отменяет формирование WAT в пользу BAT (Calo et al., 2010). Инактивация pRb сопровождается повышением уровня белка Ucpl, ключевого фактора в образовании бурого жира. Например, МЭФ от мышей с генотипом RB-/- экспрессируют Ucpl на уровне, подобном таковому в аднпоцитах ВАТ, показывая, что в нормальных условиях pRb играет роль переключателя дифференцировки, способствуя формированию адипоцитов WAT в ущерб ВАТ (Hansen et al., 2004). В WAT со сниженной экспрессией pRb увеличивается число митохондрий, повышается экспрессия ВАТ-специфических и снижается экспрессия WAT-специфическнх генов (Hallenborg et al., 2009). До индукции ЖД МЭФ, лишённые pRb, экспрессируют повышенный уровень миогенного тканеспецифического фактора — миогенина, и тяжёлой цепи мышечного миозина. Эти данные дают возможность предположить, что pRb тормозит коммитирование МСК в клетки-предшественники миоцитов/ВАТ (Schneider et al., 1994). С другой стороны, фенотип ВАТ рекапитулирует после инактивации pRb в зрелых WAT по таким признакам, как повышение расхода энергии, потребление кислорода, увеличение термогенеза и числа митохондрий (Dali-Youcef et al., 2007).
В фазе детерминирования выбор клеточной судьбы осуществляется делящимися клетками, в которых проявляется роль pRb как регулятора клеточного цикла, возможно влияющего на формирование клеточной полярности и распределение детерминант клеточной судьбы. Участие в регуляции терминальной дифференцировки основано на способности pRb или комплексов pRb/E2f взаимодействовать или изменять продукцию многих транскрипционных тканеспецифических факторов, направляющих спецификацию СК в различных клеточных линиях, например с MyoD при мышечной дифференцировке (Gu et al., 1993), или с Ррагу — при жировой (Calo et al., 2010). С другой стороны, опубликованы данные об активирующем действии pRb на фактор C/Ebpß, который приобретает чувствительность к взаимодействию с pRb после модификации путём фосфорилирования в стадии терминальной дифференцировки (Chen et al., 1996). К реагентам, которые вызывают ЖД во многих системах, относятся инсулин, инсулиноподобный ростовой фактор, глюкокортикоиды, трийодотиронин и cAMP (Spiegelman and Green, 1980). Находясь в фазе G0/G1, преадипоциты получают митогенные и адипогенные сигналы и синхронно входят в клеточный цикл, совершая несколько клеточных делений, названных митотической клональной экспансией. После завершения клональной экспансии клетки выходят из цикла и терминально дифференцируются (Рис. 7). Торможение клональной экспансии рапамицином,
Вы всегда можете написать нам и мы предоставим оригиналы страниц диссертации для ознакомления

Рекомендуемые диссертации данного раздела