Конструирование плазмидных векторов для изучения пренилирования белков возбудителя туляремии

  • Автор:
  • Специальность ВАК РФ: 03.01.06
  • Научная степень: Кандидатская
  • Год защиты: 2013
  • Место защиты: Москва
  • Количество страниц: 151 с. : ил.
  • бесплатно скачать автореферат
  • Стоимость: 230 руб.
Титульный лист Конструирование плазмидных векторов для изучения пренилирования белков возбудителя туляремии
Оглавление Конструирование плазмидных векторов для изучения пренилирования белков возбудителя туляремии
Содержание Конструирование плазмидных векторов для изучения пренилирования белков возбудителя туляремии

Оглавление
Введение
1. Обзор литературы
1.1. Туляремия
1.2. Механизм инфекционного процесса, вызываемого Ргапс 'иеИа
1.3. Липидные посттрансляционные модификации и методы их изучения
1.4. Превалирование
1.4.1. Механизм пренилирования
1.4.2. Предсказание пренилирования белков
1.4.3. Пренилирусмые белки эукариот
1.4.4. Белки патогенных микроорганизмов, пренилируемые в клетках эукариот..
1.4.5. Небелковое пренилирование у бактерий
1.5. Ингибиторы пренилирования
1.6. Заключение
2. Материалы и методы исследований
2.1. Бактериальные штаммы, плазмиды и условия культивирования
2.2. ДНК манипуляции и клонирование
2.3. Трансформация бактерий
2.4. Оценка дефективности роста бактерий
2.5. Биоинформатические методы и статистика
2.6. Культура клеток и условия культивирования
2.7. Трансфекция эукариотических клеток
2.8. Подсчет количества клеток
2.9. Инфекция эукариотических клеток, оценка способности бактерий инфицировать и размножаться внутри эукариотических клеток
2.10. Лизис клеток
2.11. Определение концентрации белка
2.12. Электрофорез в ПААТ и иммуноблотинг
2.13. Окраска ПААТ

2.14. Очистка и концентрирование белковых фракций
2.15. Определение хитииазной активности
2.16. Клик-Иг метод
3. Результаты собственных исследований
3.1 Разработка генетической системы для комплементаций делеционных мутаций генов в РгапсРсИа и ее тестирование
3.1.1. Разработка и создание вектора с полилинкером для молекулярного клонирования
3.1.2. Клонирование ФТН-0
3.2. Клонирование генов из генома Р. ш1агет1з БСНИ Б
3.2.1. Биоинформатические исследования
3.2.2. Клонирование генов ФТТ-0482, ФТТ-0502, ФТТ-1693, ФТТ-0900 в вектор для экспрессии в эукариотических клетках
3.2.3. Экспрессия и изучение пренилирования белков в клетках человека
3.3. Изучение пренилирования белков Р. пойс!(1а Ш12 методом инфекций культуры клеток
3.4. Клонирование и анализ гена ФТН-0
4. Обсуждение результатов исследований
Выводы
Список использованной литературы
Список использованных сокращений
Список иллюстративного материала
ПРИЛОЖЕНИЯ
Введение
Туляремия - это инфекционное заболевание, характеризующиеся воспалительной модификацией ворот входа инфекции. Человек может заразиться при контакте с больным животным или его трупом, через зараженную воду, еду или укус насекомого (комары, клещи, слепни). Это заболевание относится к природно-очаговым зоонозам разных видов грызунов, зайцеобразных, насекомоядных, сумчатых, хищников, копытных, птиц, амфибий, рыб и беспозвоночных (более ВО видов животных) [1]. Также человек может заразиться при вдыхании аэрозолей, при таком способе инфицирования развивается легочная форма туляремии.
Эндемические очаги туляремии регулярно проявляются на территории Российской Федерации и соседних стран [5]. Возбудителем туляремии является грамотрицательпая неподвижная кокоподобная палочка РгапЫьеИа пйагет'ю. Бактерии Р. ш1агетР считаются очень контагиозными из-за очень малой инфекционной дозы, считается, что 10 бактериальных клеток [46] способны вызвать заболевание человека. Именно из-за такой низкой инфекционной дозы и легкости распространения с аэрозолями Р. Ш1агетк причисляют к бактериям, которые потенциально можно использовать в качестве биологического оружия [92]. Отдел Здоровья и Безопасности США внес К ийагетк в список особо опасных агентов класса А [69]. В Российской Федерации согласно санитарно-эпидемиологических правил СП 1.3.2322-08 (прил.1) по классификации микроорганизмов - возбудителей инфекционных заболеваний человека Р Ьйагет'ю отнесен ко II группе патогенности.
В последнее десятилетие накопилось огромное количество данных, полученных в результате секвенирования геномов, на данный момент полностью секвенировано более десятка геномов разных штаммов РгапЫБеИа, в том числе Р. Ш1аге1шя 8 С МП 84. Для изучения функций генов Ргапс1.че11а созданы библиотеки мутантных штаммов, непатогенных для человека [75]. Вместе с тем, генетические

семейств Ras, Hdj2, ядерных ламинов и RheB подвергаются фарнезилировашпо [76], а семейств Rac, RhoA, Cdc42 и с-субъединицы гетеротримерных G-белков — геранилгеранилированиго [105]. Многие пренилируемые белки хорошо изучены в качестве участников процесса передачи сигналов. Дополнительные функции пренилированных белков входит участие в процессах клеточной дифференцировки, пролиферации, апоптоза и общего метаболизма. Полное подавление процесса пренилирования приводит к гибели клеток человека [76, 165].
Пренилированные ГТФазы семейства Ras прикреплены к мембране клетки и передают сигнал от поверхностных рецепторов к транскрипционным факторам, работающим внутри ядра. Белки семейства ГТФаз Rho могут быть расположены как в плазматической мембране (Racl), так и на эндомембранах (RhoH) или же эндосомах (RhoD) [76, 153]. С-концы белков H-Ras и N-Ras содержат как пренилированный цистеин в позиции 186, так и пальмитоилированпый цистеин в позиции 181 [113], который обусловливает выход этого белка из комплекса Гольджп и его транспорт к мембране клетке [113]. Для пренилирования Racl также показана необходимость пальмитоилироваиия, которое происходит по цистеину в позиции 178 и определяет его локализацию в участках мембраны, соответствующих местам прикрепления актипового цитоскелета [113].
Ядериые ламины образуют фибриллярную сеть, поддерживающую внутреннюю мембрану ядра. Эти белки также контролируют организацию хроматина, репликацию ДНК и закрепление норовых комплексов в процессах роста и деления клетки [76]. Заякоривание ламина на внутренней мембране ядра является необходимым условием для его нормального функционирования [76], [115]. Большинство мутаций в ламин-кодирующих генах приводят к нарушению нормальной функции этих белков, и развитию первичных ламинопатий, поражающих поперечнополосатую мускулатуру, периферические нервы и жировую ткань, что приводит к дегенерации внутренних органов и преждевременному старению [76, 115].

Рекомендуемые диссертации данного раздела