Lux-оперон Photorhabdus luminescens ZMI и его аналитическое применение

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава I Биология и физиология люминесцентных бактерий

1. Таксономия люминесцентных бактерий и основные характеристики РкоШЬаЪйи8 Ыттеясет

2. Биологические особенности РИо1огкаЬс1и8 1ит/пе$сеп

3. Физиологические свойства РкоЮгкаЬ/Зия Ыттевсет

4. Контроль синтеза и активности люминесцентной системы

Глава II Люминесцентные системы бактерий

1. Реакция бактериальной люциферазы

2. Связь люминесцентной системы с электрон-транспортными цепями бактерий

3. Структура бактериальной люциферазы

4. Механизмы бактериальной люминесценции

Глава III Генетическая организация /нх-оперона люминесцентных бактерий

Глава IV Аналитическое применение микроорганизмов, содержащих /юс-опероны

1. Использование диких типов люминесцентных бактерий в мониторинге объектов окружающей среды

2. Биосенсоры на основе генно-инженерных микроорганизмов, содержащих /их-опероны

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Глава V Объекты и методы исследования

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Глава VI Клонирование и определение нуклеотидной последовательности /ux-оперона Photorhabdus luminescens ZM

1. Рестрикционное картирование /их-оперона Photorhabdus luminescens ZM

2. Экспрессия /мх-генов Photorhabdus luminescens ZM

3. Определение нуклеотидной последовательности генов lux А и 1ихВ Photorhabdus luminescens ZM

Глава VII Изучение температурных зависимостей интенсивности биолюминесценции генно-инженерных бактерий Escherichia coli, содержащих lux-гены Photorhabdus luminescens ZM

Глава VIII Определение токсичности с использованием биосенсора на основе lux-генов Photorhabdus luminescens ZM

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ



ВВЕДЕНИЕ

Люминесцентные бактерии составляют достаточно узкую группу с ограниченным числом видов, объединенных свойством излучать видимый свет. Многочисленные фундаментальные исследования /шг-оперонов морских люминесцентных бактерий показали наличие структурных и регуляторных генов, ответственных за синтез и экспрессию фермента люциферазы, осуществляющей генерацию квантов света. Биолюминесцентные бактерии рода Рко№гкаЬс1ш к настоящему времени являются одними из наименее изученных, однако уже имеющиеся данные о некоторых их специфических свойствах (к примеру, более высокий температурный оптимум люциферазы) позволяют утверждать, что изучение этих бактерий, особенно в связи с возможностями их практического применения, открывает широкие перспективы. Вообще, вопросы, связанные с функционированием и регуляцией биолюминесцентной системы Рко^гкаЪйш Ытте.нсепх. ее сходство и отличие от таковой у морских люминесцентных бактерий, особенно интересны.

В последние годы проводятся интенсивные работы по переносу конструкций, содержащих гены, ответственные за синтез люминесцентной системы (/юс-оперон), в другие микроорганизмы. В настоящее время 1их-система является одной из наиболее распространенных репортерных систем, используемых для изучения экспрессии генов в бактериях. Так, например, использование способности люциферазной системы к биолюминесценции позволяет судить о силе промоторов. Ещё одной областью практического применения 1их-системы является создание биосенсоров к различным токсическим веществам с использованием интактных люминесцентных бактерий.

Применение живых микроорганизмов для решения аналитических задач имеет свою историю и определяется рядом несомненных преимуществ. К числу таких преимуществ следует отнести: технологическую простоту их производства и низкую стоимость; целые клетки содержат полный набор



воздействие испытуемого образца; приборные средства, предназначенные для регистрации информации и др. (Фомин, Ческис, 1992). Биологические тест-системы, используемые как первичные методы оценки токсичности отдельных веществ и их смесей, позволяют учитывать общий индекс токсичности, а также синергизм и антагонизм смеси токсикантов. Однако большинство таких анализов длительны во времени (24 часа и более), требуют большого количества анализируемого материала и весьма субъективны, поскольку связаны с подсчётом процента повреждённых и погибших организмов или изменением их свойств (Bringmann, Kuhn, 1980; Quereshi et al., 1982; Pardos et al., 2000).

Сравнительная оценка различных биологических тест-систем, проведённая в последние десятилетия в разных странах, позволила выделить из множества биотестов - люминесцентный бактериальный тест, в значительной степени свободный от вышеназванных недостатков. Люминесцентные бактерии содержат фермент люциферазу, осуществляющую трансформацию энергии химических связей жизненно важных метаболитов в световой сигнал на уровне, доступном для быстрых и количественных измерений. Поэтому различные воздействия на метаболизм клетки приводят к изменению интенсивности их биолюминесценции. Биолюминесцентная система люминесцентных бактерий оказалась чувствительной к различным ксенобиотикам: фенолы, формальдегид, тяжёлые металлы, спирты, гербициды, микотоксины, наркотики и лекарственные препараты (Ганшин, Данилов, 1997; Bulich et al., 1981; Yates, Porter, 1982; Stewart, 1990; Steinberg et al., 1995; Kaiser, 1998; Pardos et al., 2000). Это обстоятельство позволило разработать ряд различных высокочувствительных аналитических методов оценки токсичности различных образцов, основанных как на тушении свечения люминесцентных бактерий - биосенсоров с полноразмерным функционально активным 1их-опероном, например, в случае тест-системы Microtox (Bulich et al., 1990; Stewart, 1990), так и на активации люминесценции «темновых» штаммов бактерий с «дефектным» /wx-опероном (Ulitzur et al., 1980).