Влияние трансдоминантных ингибиторов на функциональную активность онкосупрессора р53

  • Автор:
  • Специальность ВАК РФ: 03.00.03
  • Научная степень: Кандидатская
  • Год защиты: 2003
  • Место защиты: Москва
  • Количество страниц: 114 с. : ил
  • Стоимость: 250 руб.
Титульный лист Влияние трансдоминантных ингибиторов на функциональную активность онкосупрессора р53
Оглавление Влияние трансдоминантных ингибиторов на функциональную активность онкосупрессора р53
Содержание Влияние трансдоминантных ингибиторов на функциональную активность онкосупрессора р53
СОДЕРЖАНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИИ
ВВЕДЕНИЕ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Г лава 1. Молекулярная организация и эволюция семейства генов р 53.
Г лава 2. Регуляция экспрессии гена р53.
Глава 3. Доменная организация белкар53.
N-концевой трансактивационный домен SH3-прол иновы й домен
- ДНК-связывающий домен Олигомернзационный домен
- С-концевой регуляторный
Г лава 4. Функции белка р53.
- р53-зависимая трансактивация
- р53-зависимая трансрепрессия и белок-белковые взаимодействия
- р53-зависимый контроль клеточного цикла
- р53-зависимый апоптоз
Выбор пути: остановка клеточного цикла или апоптоз?
- р53 в процессах репарации и репликации ДНК
- р53 в процессах клеточной дифференцировки и развития организма
- р53 и ангиогенез
- р53 и старение
Глава 5. Регуляция функций р53.
- Механизмы регуляции функций р
- Регуляция стабильности р
- Регуляция активности р
- Регуляция субклеточной локализациир
Глава 6. Роль р53 в онкогенезе.
“Gain of function ’’-мутации р
- Доминантно-негативные ши транс-доминантные мутации р
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
1. Получение компетентных клеток Escherichia coli и трансформация.

2. Препаративное и аналитическое выделение плазмидной ДНК.
3. Обработка ДНКрестрицирующими эндонуклеазами.
4. Фракционирование и извлечение ДНК из агарозных гелей.
5. Реакция лигирования.
6. Полимеразная цепная реакция и экстракция РНК из эукариотических клеток.
7. Клеточные линии и их культивирование.
8. Лизис клеток и измерение концентрации белка по методу Бредфорда.
9. Иммунопреципитация белков и ковалентное соединение моноклональных антител с белком А на сефарозе.
10. Фращионирование белков в полиакриламидном геле.
11. Перенос белков на фильтры и иммунодетекция.
12. Трансфекция ретровирусных и плазмидных конструкций методом калыщй-фосфатной преципитации.
13. Инфекция клеток рекомбинантными ретровирусами и селекция на антибиотике устойчивых культур.
14. Анализ активности /3-галактозидазы (Х-%а1-реакция).
15. Иммунофлуоресцентный анализ содержания белков в клетках.
16. Детекция апоптотической клеточной смерти (ТиМЕ!.-реакция, обработка клеток аннексином/флуоресцеином и хехстом 33258).
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
wt (wild type) - дикий тип;
р53- нативный wt-p53 человека;
р53^',„- химерный wt-p53 человека, в котором олигомеризационный домен белка заменен на олигомеризационный домен р53 курицы;
р53)и р53'.^т - К175Н-мутанты нативного и химерного р53 человека
соответственно;
GSE22 - Genetic Suppressor Element 22.
ВВЕДЕНИЕ
Ген р53 - один из наиболее ярких и интенсивно исследуемых представителей генов-супрессоров опухолевого роста. Он (или его аналог) присутствует не только в геномах всех позвоночных, но также, по-видимому, в геномах всех многоклеточных организмов, что подчеркивает его значимость. Продукт гена - тетрамерный белок р53 является одним из важнейших транскрипционных факторов и регуляторов клеточного цикла и апоптоза. В нормально пролиферирующих клетках р53 - короткоживущий белок с быстрой оборачиваемостью: время его жизни не превышает 20 минут. При генотоксических и цитотоксических стрессах р53 быстро стабилизируется за счет посттрансляционных ковалентных модификаций, сопровождающихся прекращением его деградации, что приводит к резкому повышению концентрации белка в клетке. Белок сосредотачивается в клеточном ядре, переходит в активированную для сайт-специфического связывания с ДНК форму, и за счет активации или репрессии транскрипции генов-мишеней “включает” программы:
1) остановки клеточного цикла на время репарации возникших повреждений ДНК, 2) клеточной смерти по типу апоптоза или 3) необратимого клеточного старения. В итоге многоклеточный организм избавляется от клеток с повреждениями генетического аппарата, способными к опухолевой трансформации. В связи с этой охранной функцией р53 был назван хранителем целостности и стабильности генома. Помимо своих основных функций р53 участвует также в процессах репарации и репликации ДНК, развития и старения организма, клеточной дифференцировки и ангиогенеза, оказывая, таким образом, плейотропное воздействие на организм. Функции р53 в

работы, чтобы позволить клетке дальше продвигаться по циклу. Считается, что главньми механизмами регуляции функций р53 являются посттрансляционные ковалентные модификации белка и белок-белковые взаимодействия, модулирующие функциональную активность р53 (Meek D.W., 1999). Предполагается, что тип и аминокислотный сайт модификации р53, а также сигнальный путь и способ передачи стресс-сигнала на р53, зависят от характера этого сигнала (Giaccia A.J. et al„ 1998). Например, активация онкогенов “включает” р53 преимущественно через его взаимодействия с белком ARF, а облучение - через ковалентные модификации N- и С-концевых доменов р53, причем ионизирующие и ультрафиолетовые лучи задействуют разные сигнальные пути и/или модифицируют разные аминокислотные остатки р53 (Lakin N.D. et al., 1999; Meek D.W., 1999). Ковалентные модификации р53 включают: фосфорилирование (дефосфорилирование), ацетилирование (деацетилирование), рибозилирование, О-гликозилирование, убикитинирование и модификации убикитин-родственным белком - SUMO-1 (small ubiquitin-like modifier 1) - “сумойалирование”.
Фосфорилирование р53.
In vitro показано, что существует множество потенциальных сайтов фосфорилирования р53, причем они сконцентрированы на N- и С-концевых доменах белка. У человека это серины 9, 15, 20, 33, 37, 315, 376, 371, 378, 392 и треонин 18; у мыши серины 4, 6, 9, 15, 18, 34, 309, 386 и треонины 73, 83. Множество протеинкиназ задействовано in vitro в этом процессе: CKI и СКИ (casein kinase I and II), Cdks (cyclin dependent kinases), CAK (Cdk-activating kinase), DNA-PK (DNA-dependent protein kinase), ATM (ataxia-teleangiextasia mutated), ATR (ATM and Rad3 related), JNK (Jun amino-terminal kinase), МАРК (mitogen-activated protein kinases): ERK1 и ERK2 (extracellular signal regulated kinase 1 and 2), PKA (protein kinase A), PKC (protein kinase C), PKR (protein kinase activated by double-stranded RNA), Raf. In vivo, однако, достоверно пока показано участие в фосфорилировании р53 человека лишь трех киназ PIKK (phosphoinositide 3 kinase related kinases)-ceMeftcTBa: ATM, ATR и DNA-PK (Jimines G.S. et al., 1999; Lakin N.D. et al., 1999; Meek D.W., 1999).
Герминальные мутации гена ATM связаны с мультисистемным аутосомно-рецессивным заболеванием - атаксией-телеангиэктазией, сопровождающейся прогрессирующим разрушением мозжечка, телеангиэктазией, преждевременным старением, иммунологическими нарушениями, хромосомной нестабильностью и повышенной чувствительностью к ионизирующему облучение - риск развития рака при этом возрастает в 100 раз. Установлено, что протеинкиназа ATM активируется в ответ на ионизирующее (ИО), но не ультрафиолетовое (УФ) облучение (Khanna К.К. et

Рекомендуемые диссертации данного раздела