Капиллярный электрофорез как метод идентификации форм существования, оценки фармакологических свойств и анализа противоопухолевых комплексов металлов

Введение

Актуальность темы. Несмотря на значительные успехи в диагностике и лечении различных заболеваний с использованием соединений металлов, остается еще немало белых пятен в понимании механизма их действия. Такая ситуация затрудняет направленную разработку новых препаратов, обладающих более высокой и разнообразной по действию физиологической активностью и одновременно пониженной токсичностью. Другим и, пожалуй, более серьезным недостатком является невысокая эффективность процесса создания новых металлосодержащих лекарственных средств: только одно из тысячи испытанных соединений получает официальный статус. Это приводит к тому, что средняя стоимость разработки одного лекарства приближается к одному миллиарду долларов США. К тому же весь процесс разработки - от времени синтеза и начала исследований до поступления препарата в продажу -занимает до 15 лет.

Ускорение поиска и более целеустремленное исследование новых лекарственных веществ должно привести к снижению общих затрат на их разработку (главным образом, за счет сокращения числа неудачных препаратов). Этого можно достичь за счет улучшения аналитических методов, находящихся в арсенале биохимических и фармацевтических лабораторий. Принципиальным требованием к таким методам является способность разделять и определять отдельные комплексы металлов, оказывая минимальное воздействие на их состав в ходе анализа. С этих позиций важное место в разработке металлосодержащих целевых соединений, главным образом, противоопухолевого действия может занять капиллярный электрофорез (КЭ). Немаловажным при выборе КЭ является ряд его сопутствующих достоинств: простота аппаратурного оформления, разработки методики и проведения самого анализа; минимальный объем необходимой пробы; совместимость с физиологическими условиями; сочетаемость с различными методами детектирования и, что особенно важно при анализе

смесей, содержащих множество метаболических форм часто с разной полярностью заряда, - высокая эффективность разделения. Кроме того, время анализа обычно невелико (в пределах 10 мин). Это сводит к минимуму возможные изменения в исходном распределении комплексных форм металлов в разделительной системе.

Цель и задачи исследования. Основная цель работы состояла в расширении аналитических возможностей КЭ при исследовании комплексов металлов с целью их более эффективной разработки в качестве противоопухолевых лекарственных средств.

Достижение поставленной цели предусматривало решение следующих задач:

- совершенствование методологии КЭ для оценки устойчивости и взаимодействий комплексов металлов с белками и другими компонентами крови в модельных физиологических условиях (с учетом особенностей регистрации быстрых и медленных процессов);

- адаптацию гибридного варианта КЭ, в сочетании с масс-спектрометрией с индуктивно связанной плазмой (ИСП-МС), для идентификации образующихся белковых форм металлов и исследования особенностей связывания комплексов металлов белками (в том числе в сыворотке крови);

оценка фармакологических свойств, отвечающих за достаточную концентрацию противоопухолевых соединений металлов в плазме крови (устойчивость к гидролизу, липофильность, реакционная способность по отношению к белкам) с использованием оптимизированных вариантов КЭ;

- сравнительный анализ кинетических данных с целью выявления белков, способных осуществлять преимущественное накопление в крови и перенос данного химиотерапевтического средства в раковую клетку, а также установления структурных закономерностей по связыванию комплексов одинакового металла различными белками;

- применение КЭ для анализа и контроля качества готовых препаратов;



- развитие возможностей мицеллярной электрокинетической хроматографии (ЭКХ) для концентрирования комплексов металлов из растворов с высоким солевым составом в режиме реального времени.

Научная новизна. Предложен систематический подход к исследованию процессов, сопровождающих введение и метаболизм противоопухолевых комплексов металлов, который позволяет: 1) регистрировать несвязанную и связанную (с биомолекулой) формы металлов без нарушения их состава в ходе КЭ-анализа (за счет применения растворов фоновых электролитов, совпадающих по составу с физиологическим раствором); 2) регистрировать с достаточной воспроизводимостью сигналы в присутствии белковых молекул, обладающих высокой адсорбционной способностью по отношению к материалу кварцевых капилляров, при концентрациях комплексов металлов, близких к терапевтическим содержаниям; 3) измерять скорость гидролиза и связывания с белками по изменению интенсивности сигнала исходного комплекса или образующегося аддукта соответственно; 4) разделять аддукты с различными белками, в том числе при физиологическом соотношении их концентраций и в составе сыворотки крови, и проводить in vitro мониторинг их метаболических превращений.

Развит комбинированный метод, сочетающий КЭ и ИСП-МС, для изучения взаимодействия комплекса рутения(Ш), находящегося на стадии клинических испытаний, с белками крови, идентификации образующихся аддуктов и оценки их устойчивости под действием компонентов крови с восстановительным действием. Впервые исследованы формы существования противоопухолевого комплекса галлия орального действия в реальном объекте

- сыворотке крови.

Предложен высокопроизводительный способ оценки относительной липофильности цитотоксических комплексов металлов различного структурного типа и заряда, основанный на зависимости параметров миграции соединений в ЭКХ от величин констант распределения в системе н-октанол-вода (log Р).



круг исследованных соединений (за редким исключением, это комплексы платины и рутения); б) некомплексный подход к оценке их фармакологических свойств; в) недостаточное внимание к скринингу соединений в рамках принципа количественной взаимосвязи структура-активность; г) единичные работы по анализу готовых лекарственных форм и др. Если связывание с внеклеточными биологическими мишенями, такими как белки крови, изучено достаточно полно (хотя в подавляющем числе работ только в модельных физиологических условиях), то устойчивость образующихся аддуктов в присутствии других компонентов крови остается невыясненной.

Как было показано в обзоре, особый интерес представляет гибридный вариант КЭ, в котором в качестве детектора используют масс-спектрометр с ИСП. Этот вывод подтверждается в большинстве обзорных работ самых последних лет [73-79], в том числе при соавторстве автора диссертации [62]. Указанный метод детектирования является, по сути, единственным, который способен надежно и с высокой чувствительностью идентифицировать формы металлов, образующиеся в результате метаболизма металлосодержащих лекарств. Однако исследования с использованием реальных биологических объектов практически отсутствуют. Это, несомненно, снижает практическую ценность результатов. В этой связи необходимо также отметить, что за пределами внимания специалистов по КЭ, работающих в области, остается разработка схем концентрирования, пригодных для анализа биологических жидкостей.

Решению отмеченных выше проблем и посвящена данная диссертационная работа. В качестве основных противораковых соединений, используемых для выработки более совершенной методологии КЭ, нами выбраны КР46 и КР1019. Оба соединения находятся во второй стадии клинических испытаний и относятся к наиболее перспективным соединениям металлов, разрабатываемым в настоящее время. Ожидается, что результаты описанных в последующих главах исследований помогут не только