Протеализин - новая протеиназа Serratia proteamaculans 94: структура, свойства и перспективы практического использования

ВВЕДЕНИЕ.
Актуальность работы 
Цели исследовании.
Научная новизна
Практическая значимость. 
Положения, выносимые на защиту 
ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР. СТРУКТУРНОФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ТЕРМОЛИЗИНПОДОБНЫХ ПРОТЕИНАЗ.
1.1. Организация каталитических доменов. .
1.1.1. Организация сайтов связывания ионов кальция.
1.1.1.1. Первый двойной сайт связывания ионов кальция Са1,
1.1.1.2. Третий сайт связывания ионов кальция СаЗ
1.1.1.3. Четвертый сайт связывания ионов Са4.
1. 1.2. Организация каталитического центра
1. 1.3. Организация субстратсвязывающей области.
1.1.4. Открытая и закрытая конформация молекул ТПП
1.2. Структура предшественников термолн ппншдобнмх протеина 
1.2.1. Структура и функции длинных АКР предшественников ТПП.
1.2.2. Структура и функции коротких АКР предшественников ТГ1П.
1.2.3. Функции Сконцевых регионов предшественников ТГ1П
1.3. Механизмы удаления концсвых пропептидов термолизинподобных протеинах.
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Материалы ммииинмж1ж1ммнж1нммма1ми1м1ммжнмнннм1иинии1имм1и1 
2.2. Общие методы 
2.2.1. Состав питательных сред
2.2.2. Трансформация бактериального штамма ii i.
2.2.3. Выделение плазмиднон ДНК.
2.2.4. Определение нуклеотидной последовательности ДИК
2.2.5. Электрофоретический анализ нуклеиновых кислот
2.2.6. Полимеразная цепная реакция
2.2.7. Гснноимжснсрныс манипуляции с ДНК.
2.2.8. Электрофоретический анализ белков
2.2.9. Определение протеолитичсской активности ферментов
2.2 Количественное определение белка
2.2 Массспсктрометрнчсскнй анализ
2.2 Определение коицевой аминокислотной последовательности
2.2 Расчет изоэлекгрической точки.
2.2 Анализ аминокислотных последовательностей и пространственных структур.
2.3. Очистка зрелого нротсализина 
2.4. Влияние на стабильность протсалнзнна.
2.5. Оптимум протеолитической пюпвностн. 
2.6. Влияние температуры на стабильность протеалнлша 
2.7.Температурный оптимум протеолитичсской активности
2.8. Влияние ионов кальция на стабильность фермента.
2.9. Влияние ингибиторов 
2 Определение константы гидролиза ФАГЛА протеализином. 
2 Аналитическая гельпроиикающая хроматография
2 Оценка возможности использования рекомбинантного протеалииша к нишевой промышленности
. Получение ферментного препарата в колбах.
. Оценка термоинактивации протеалнзина в ферментном препарате
. Получение ферментного препарата в ферментере на 0 л
. Технологическая схема выработки варенокопченой колбасы с использованием ферментного препарата, полученного из генноинженерного штамма
2 Конструирование векторов для экспрессии генов модифицированных предшественников
протеалнзина ИННМММНММНМНММНМЖМММИНМНИИМНМтНМММИНИНМИММ 
2 Очистка зрелого протеалнзина с шестью гистидинами на Сконце молекулы Р1пШ
2 Очистка предшест венника протеалнзина ргоМпНвд
2 Очистка предшественника протеалнзина с мутацией в активном центре ргоР1пНА
2 Ингибирование активности протеалнзина РпН.
2 Процессинг предшест венника протеалнзина ргоРпНвй .
2 Процессинг предшественника протеалнзина ргоРпН при различных .
2 Процессинг предшественника протеалнзина ргоРпНьб на Мг1ТКагарое.
2 Ингибирование процессинга предшественника протеалнзина ргоРп 
2 Процессинг мутантного предшественника протеалнзина активными нротепназами ргоРпНеА .
2 Кристаллизация и рентгеновские исследования крист аллов мутантного предшественника протеалнзина 
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.
3.1. Анализ аминокислотной последовательности протеалнзина 
3.2. Очистка зрелого протеалнзина 
3.3. Характеристика нротсализнна ММЖИМЖМаМ1МММММИММММ1М1М1ЖНМММН1МММ1Н1МИМ1ММН 
3.3.1. Аминоконцевая последовательность зрелого протеализина
3.3.2. Молекулярная масса зрелого протеалнзина.
3.3.3. Влияние , температуры и ионов кальция на активность протеализина
3.3.4. Влияние ингибиторов на активность протеализина
3.3.5. Изучение кинетики гидролиза ФАГЛА.
3.4 Опенка возможности использования рекомбинантного протеализина в пищевой промышленности . .
3.5. Процессинг предшественника протеализина
3.5.1 Конструирование и экспрессия модифицированных генов протеализина.
3.5.2. Очистка и некоторые свойства зрелого протеализина, несущею шестигистндиновую последовательность на Сконпс молекулы
3.5.3. Процессинг предшественника протеализина.
3.6. Пространственная организация предшественника протеалнзина.
3.6.1. Получение кристаллов предшественника протеализина.
3.6.2. Анализ пространственной структуры предшественника протеализина
3.6.2.1. Анализ сайтов связывания кальция.
3.6.2.2. АУИОшпилька.
3.6.2.3. Структурная организация пропептида л его взаимодействие со зрелой частью.
ВЫВОДЫ.
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ


Одним из наиболее активно развивающихся направлений современной биотехнологии является использование широкого круга ферментов в технологических процессах. Среди таких ферментов важную роль играют протеиназы. Они используются в медицине, косметологии, индустрии моющих средств, пищевой и кожевенной промышленности, а также для ферментативного синтеза пептидов 1. Однако, несмотря на большое разнообразие природных ферментов, их свойства часто не оптимальны для технологических процессов. Для решения этой проблемы могут быть использованы два основных подхода. Первый заключается в поиске новых природных ферментов с подходящими характеристиками, а второй в направленной модификации уже известных и хорошо охарактеризованных белков. Второй подход кажется более привлекательным, поскольку позволяет конструировать ферменты оптимальные для данного биотехнологического процесса. Фундаментом для реализации этого подхода является изучение структурнофункциональной организации белков. В лаборатории белковой инженерии Института молекулярной генетики РАН в результате широкомасштабного скрининга микроорганизмов, добытых из необычных природных и промышленных источников, был отобрал штамм i , который способен с высокой эффективностью гидролизовать нативный коллаген при низких положительных температурах. Ферменты, которые определяют такую способность данного штамма, перспективны для использования в пищевой промышленности, так как могут избирательно разрушать соединительную ткань в составе мясного сырья. С целью клонирования генов протеолитических ферментов была создана геномная библиотека i , при анализе которой был охарактеризован ген новой металлопротеиназы протсализииа, относящейся к семейству пептидаз М4 термолизинподобных протеиназ. Изучение структурнофункциональной организации протеализина представляет интерес как с прикладной, так и с фундаментальной точки зрения. С одной стороны, этот фермент перспективен для использования в мясоперерабатывающей промышленности для улучшения качества низкосортного мясного сырья. А с другой стороны, структурные особенности предшественника протеализина делают его удобной моделью для изучения механизмов действия пропеп гидов пептидаз семейства М4. Целями данной работы являются исследование структуры и свойств протеализина, а также оценка возможности применения рекомбинантного фермента в пищевой промышленности для улучшения качества мясного сырья. В ходе данной работы впервые очищен и охарактеризован протеализин новая протеиназа i . Проведен анализ первичной структуры протеализина и показано, что протенназы, имеющие структуру схожую с предшественником протеализина, образуют отдельную группу внутри семейства термолизинподобных протеиназ. Впервые детально изучен механизм созревания предшественника фермента, относящегося к этой группе. Получены кристаллы предшественника протеализина и впервые решена пространственная структура предшественника ТПП. Данные, полученные в ходе работы, показали, что на основе протеализина может быть создан препарат для улучшения качества низкосортного мясного сырья. Эти результаты позволяют перейти к конструированию промышленных продуцентов протеализина. Информация о структурнофункциональной организации предшественника протеализина может быть использована для создания на основе этого белка ферментов с направленно модифицированными свойствами. Анализ первичной структуры, очистка и изучение свойств рекомбинантного протеализина. Оценка возможности использования рекомбинантного протеализина в пищевой промышленности для улучшения качества низкосортного мясного сырья. Изучение механизма созревания предшественника протеализина. Кристаллизация предшественника протеализина и установление его пространственной структуры. Анализ пространственной структуры предшественника протеализина. Работ поддержана грантами РФФИ 4а Структурные основы низкотемпературной активности ферментов. Новая психрофильная коллагеназа, 8а Пропсптиды как модуляторы функциональной активности белков и 3офи Создание активною при пониженных температурах коллагенолигичсского ферментного препарата для мясной промышленности.