Характеристика ядерных белков млекопитающих, взаимодействующих с триплетными повторами (GCC) a регуляторных участков генов

  • Автор:
  • Специальность ВАК РФ: 03.00.04
  • Научная степень: Кандидатская
  • Год защиты: 2001
  • Место защиты: Санкт-Петербург
  • Количество страниц: 98 с. : ил
  • Стоимость: 230 руб.
Титульный лист Характеристика ядерных белков млекопитающих, взаимодействующих с триплетными повторами (GCC) a регуляторных участков генов
Оглавление Характеристика ядерных белков млекопитающих, взаимодействующих с триплетными повторами (GCC) a регуляторных участков генов
Содержание Характеристика ядерных белков млекопитающих, взаимодействующих с триплетными повторами (GCC) a регуляторных участков генов

Содержание
ИСПОЛЬЗОВАННЫЕ СОКРАЩЕНИЯ
1. ВВЕДЕНИЕ
г. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
2.1. Регуляция транскрипции: общие принципы
2.2. Сайт-специфические транскрипционные факторы: взаимодействие с ДНК,
ДОМЕННАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ И КЛАССИФИКАЦИЯ ДОМЕНОВ
2.3. Факторы транскрипции, взаимодействующие с GC-бога гыми нуклеотидными
ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЯМИ
2.3.1. Семейство Sp 1-подобных факторов транскрипции
2.3.2. ТФ семейства Egr
2.3.3. Семейство Ар
2.3.4. (GCC)„-связывающий белок CGGBP-
2.4. СТРУКТУРНО-ФУНЦИОНАЛЬНЫЕ ОСОБЕННОСТИ (GCCX-ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
2.5. (GCC)n-ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ В РЕГУЛЯТОРНЫХ РАЙОНАХ ТЕНОВ МЛЕКОПИТАЮЩИХ И ЧЕЛОВЕКА
2.5.1. Ген рецептора липопротеидов очень низкой плотности (vldl-r)
2.5.2. Промотор рибосомного белка мыши L32 (rpL32)
2.5.3. (GCC)„-последовательности в геноме герпесвирусов
2.5.4. Область LATв геноме вируса простого герпеса 1 типа и особенности еерегулягрт
3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
3.1. Материалы исследования
3.2. Плазмиды
3.3. Генно-инженерное конструирование
3.4. получение ядерных экстр актов
3.5. Гель-ретардация
3.6. SDS-ЭЛЕКТРОФОРЕЗ БЕЛКОВ
3.7. ЛИГАНДНЫЙ БЛОТТИНГ
3.8. Аффинная хроматография ядерных белков
3.8.1. АХ на синтезированном сорбенте на основе целлюлозы
3.8.2. АХ на стрептавидт-содержащих магнитных частицах
3.9. Препаративная гель-ретардация
3.10. Анализ ДНК-связывающей активности белков связыванием на нитро-ЦЕЛЛЮЛОЗНОЙ МЕМБРАНЕ (ДОТ-АНАЛИЗ)
3.11. ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ТРАНСФОРМАЦИЯ КЛЕТОК И АНАЛИЗ ПРОДУКТОВ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ-РЕПОРТЕРОВ
4. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
4.1. ИЗУЧЕНИЕ СВОЙСТВ БЕЛКОВ, ВЗАИМОДЕЙСТВУЮЩИХ С GCC-СОДЕРЖАЩИМИ ЦИС-
ЭЛЕМЕНТАМИ
4.1.1. Изучение специфичности ДНК-белкового взаимодействия

4.1.2. Идентификация ДНК-связывающих белков, взаимодействующих с композитным цис-элементом промотора грЬ
4.2. Исследование последовательности (СЗСС)8, локализованной в 5’-
НЕТРАНСЛИРУЕМОЙ ОБЛАСТИ ГЕНА уМ-Г ЧЕЛОВЕКА, КАК ПОТЕНЦИАЛЬНОГО ЦИС-ЭЛЕМЕНТА.

4.2.1. (О С С) эл емент гена ldl-r специфически взаимодействует с ядернылш белками клеток ге-патомы человека НерС
4.2.2. (ИСС) 8-элемент гена ldl-! проявляет перекрестную специфичность с С СС эл емент ом промотора гена грЬ
4.2.3. Фрагмент 5’-нетранслируемой области гена уШ1-г вытесняется из комплексов с ядерными белками клеток Нер02 (ОСС)гэлементом, но не вытесняется полипиримидиновым блоком (РРу) фрагмента промотора грЬ
4.2.3. Взаимодействие (вСС) „-содержащих элементов в 5 '-нетранслируемом районе гена ’Ш1-г с ядерными белками зависит от ионов Ъп*
4.2.4. Делеция участка 5 '-регуляторной области (+384...+615) уШ1-г, содержащего восемь триплетов ССС, значительно усиливает активность его промотора в клетках НишНО..
4.3. Функциональная активность последовательности (ОСС)3, локализованной в
АССОЦИИРОВАННОМ С ЛАТЕНЦИЕЙ ВИРУСА Н5У-1 ПРОМОТОРЕ 1.АР
4.4. Белок СООВР-20, связывающийся с триплетными повторами (СтСС)п, может
ДЕЙСТВОВАТЬ КАК РЕПРЕССОР ТРАНСКРИПЦИИ
4.4.1. Белок СОСВР-20 способен функционировать как специфический регулятор (репрессор) транскрипции
4.4.2. Белок СДОВР-20 способен функционировать как неспецифический регулятор (репрессор) транскрипции
4.5. Выделение и очистка ядерных белков из клеток НерС2, связывающих (ОСС)
СОДЕРЖАЩИЙ КОМПОЗИТНЫЙ ЦИС-ЭЛЕМЕНТ ПРОМОТОРА грЬ
4.5.1. Очистка исследуемых белков препаративной гель-ретардацией
4.5.2. Аффинная хроматография исследуемых белков на ДНК-целлюлозе и на стрептавидин-содержащш магнитных частицах
4.5.3. Очистка ДНК-связывающих белков с применением последовательной гель-ретардации и аффинной хроматографии (комбинированный способ очистки)
5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
6. ВЫВОДЫ
7. СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

Использованные сокращения
а. о. - аминокислотные остатки
АХ - аффинная хроматография
н. п. - нуклеотидные пары
ЛПНП - липопротеины низкой плотности
ЛПОНП - липопротеины очень низкой плотности
ПААГ - полиакриламидный гель
СМЧ - стрелтавидин-содержащие магнитные частицы
т. н. п. - тысячи нуклеотидных пар
ТФ - транкскрипционный фактор
ароА-1 - ген аполипопротеина А-1 СМУ - цитомегаловирус человека ОТТ - дитиотреитол
НЕРЕ8 - М-2-гидроксиэтилпиперазин-Ы'-2-этансульфоновая кислота Н8У-1 - вирус простого герпеса человека I типа ХагЕБТА - динатриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты ХагЕвТА - динатриевая соль (этилендиокси)диэтилен-динитрилотетрауксусной кислоты
РМ8Е - фенилметансульфонилфторид грЬ32 - ген рибосомного белка Ь32 мыши 8Б8 - додецилсульфат натрия
гШ-г - ген рецептора липопрогеинов очень низкой плотности человека
В тексте строчными буквами курсивом набраны названия генов, прямым шрифтом - названия соответствующих им белковых продуктов.

В 5'-нетранслируемой области гена vldl-r идентифицирован ряд элементов регуляции транскрипции, в частности, Spl-элемент; ТАТА-бокс; стероид-зависимый элемент SRE-1; элемент, взаимодействующий с транкрипционными факторами ССААТ и NF-Y (Sakai, Hoshino et al. 1994a; Vaziri and Liang 1997; Kreuter, Soutar et al. 1999). Кроме того, там расположены две группы триплетных повторов типа (GCC)n: четыре повтора вблизи промоторной области в положении +15...+23 относительно точки инициации транскрипции, и еще 8 повторов в позиции +573...+597 (Sakai, Hoshino et al. 1994a). Было показано, что наличие в 5’-нетранслируемой области GCC-триплетов кореллиру-ет с ранними нарушениями памяти и повышает риск сосудистых заболеваний (Helbecque, Berr et al. 2001). Следует отметить, что роль триплетных повторов (GCC)n как элементов регуляции транскрипции гена vldl-r до настоящего времени никем не исследовалась.
2.5.2. Промотор рибосомного белка мыши L32 (rpL32)
Семейство генов, кодирующих мышиный рибосомапьный белок L32, содержит уникальный экспрессирующийся интронированный ген. Протяженность этого гена составляет 3.2 т. н. п. Транскрипты сплайсируются с образованием мРНК ~506 н. п., которая кодирует белок из 135 аминокислотных остатков (Dudov К. and Perry R. 1984). Промотор гена rpL32 является нетканеслецифичным, ТАТА-несодержащим, соответствует по характеристикам промоторам генов "домашнего хозяйства" (Dudov К. and Perry R. 1986). Необычные свойства промотора rpL32 заключаются в том, что он является ТАТА-несодержащим, и, в то же время, в нем отсутствуют канонические Spl-сайты, которые часто встречаются в ТАТА-несодержащих промоторах. Синтез белка L32 наблюдается только в активно пролиферирующих клетках, однако транскрипция гена мало зависит от пролиферативного статуса и, по-видимому, дальнейшая модуляция экспрессии осуществляется на уровне трансляции (Huang S. and Hershey J.W.B. 1989; Kaspar R.L., Rychlik W. et al. 1990). Делеционный анализ промотора rpL32 позволил определить элементы, важные для транскрипционной активности. Для максимальной экспрессии гена rpL32 необходим район протяженностью 150-200 н. п., содержащий сайт инициации транскрипции. Ранние исследования определили границы промотора -36...+46 н. п. (Dudov К. and Perry R. 1986), однако дальнейшие работы показали, что важна также последовательность первого интрона (Chung S. and Perry R. 1989). В положении -17...-6 этого промотора расположен участок, состоящий из четырех повторов GCC, функция которого в регуляции гена rpL32 ранее никем не изучалась.

Рекомендуемые диссертации данного раздела