NO-синтазная активность лактобацилл : обнаружение, геномные детерминанты, функции

СОДЕРЖАНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 
ВВЕДЕНИЕ. 
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. 
1.1. Синтез 0 у бактерий. 
1.1.1. Образование 0 в процессе денитрификации. 
1.1.2. синтазная система эукариот и прокариот 
1.2. Физиологическая роль 0 у прокариот. 
1.2.1. Значение экзогенного 0 для микробной клетки 
1.2.2. Сигнальная функция бактериального 0 
1.2.3. Физиологическая роль бактериального оксида азота синтазного происхождения. 
1.3. Методы идентификации 0 в биосистемах. 
1.4. Морфологические особенности поверхностных
структур лактобацилл. 
Заключение. 
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ. 
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 
2.1. Бактериальные штаммы и клеточные культуры 
2.2. Питательные среды и условия культивирования. 
2.3. Визуализация объектов исследования методами микроскопии 
2.4. Микробиологические методы. 
2.4.1. Определение динамики роста лактобацилл 
2.4.2. Анализ способности бактерий к денитрификации 
2.4.3. Анализ токсичности субстрата и ингибиторов  
2.4.3.1. Оценка токсичности аргинина и  по
выживаемости штаммов бактерий 
2.4.3.2. Оценка влияния длительного контакта бактерий
с аргинином на число КОЕ. 
2.4.3.3. Оценка влияния аргинина и  на
динамику роста бактерий 

2.4.3.4. Определение токсичности субстрата и
ингибиторов  флуоресцентным окрашиванием. 
2.5. Аналитические методы. 
2.5.1. ЭПР 
2.5.1.1. Регистрация оксида азота методом ЭПРспектроскопии. 
2.5.1.2. Построение модельной калибровочной кривой для определения концентрации 0 в зависимости от интенсивности ЭПРсигнала 
2.5.2. Определение оксида азота и АФК методом
окрашивания флуоресцентными индикаторами 
2.6. Иммунологические методы 
2.6.1. Иммунофлуоресцентный анализ 
2.6.2. Иммуноблотинг Вестернблот анализ 
2.7. Методы биоинформатики 
2.8. Статистическая обработка результатов. 
3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 
3.1. Морфологическая характеристика исследуемых лактобацилл 
3.2. Оценка возможности синтеза 0 в ходе денитрификации. 
3.3. Влияние субстрата и ингибиторов синтазы
на рост лактобацилл. 
3.3.1. Оценка влияния аргинина на рост и жизнеспособность
бактерий   
3.3.2. Оценка влияния ингибиторов  на рост и
жизнеспособность бактерий .  
3.4. Поиск генетических детерминант синтазной
активности у лактобацилл 
3.5. Выявление синтазной активности лактобацилл
прямыми методами определения 0. 
3.5.1. Идентификация синтазной активности с помощью ЭПР 
3.5.2. Регистрация синтазной активности флуоресцентным методом 
3.6. Особенности влияния аргинина и ингибиторов синтазы млекопитающих на синтазную активность лактобацилл 
3.7. Анализ иммунологических свойств синтазы лактобацилл 
I
3.8. Характеристика физиологической активности оксида азота в клетках различного уровня организации 
3.8.1. Роль 0 в культурах клеток эукариот в условиях индуцированного рибонуклеазой i ii стресса. 
3.8.2. Влияние температурного стресса на синтазную активность лактобацилл 
3.8.3. Оценка влияния индуцированного аргинином синтеза 0 на
формирование слоя у . . 
4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ. 
4.1. Альтернативные пути биосинтеза 0 у   
4.2. Физиологическая роль 0 у лактобацилл 
ВЫВОДЫ 
Благодарности. 
ЛИТЕРАТУРА


Атомную силовую микроскопию осуществляли на кафедре оптики и нанофогоники КГУ. Сканирующая электронная микроскопия выполнена на кафедре полезных ископаемых и разведочного дела КГУ. Бактерии i  обладают специфическим, отличным от денитрификации, синтазным механизмом образования оксида азота. Генетическая программа i  подтверждает наличие у них синтазной активности, отличной от синтазы эукариот и прокариот обладателей оксигеназного домена синтазы. Оксид азота синтазного происхождения у бактерий играет роль универсального фактора стрессорного и адаптивного ответов клеток. При индукции синтазы субстратом аргинином происходит изменение морфофизиологического состояния поверхности клеток i , связанное с формированием слоя. Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на XIV Всероссийской конференции Структура и динамика молекулярных систем Казань, , Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых Ломоносов   Москва, , XI Международной экологической студенческой конференции Экология России и сопредельных территорий. Федерации Европейских физиологических обществ Мюнхен, , II Международной конференции Микробное разнообразие состояние, стратегия сохранения, биологический потенциал Пермь, , 9ой Международной Пущинской школыконференции молодых ученых Биология наука XXI века Пущино, , ой всероссийской студенческой конференции, посвященной летию Казани Казань, , конференции Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии Казань, , междисциплинарной конференции с международным участием Новые биокибернетические и телемедицинские технологии века для диагностики и лечения заболеваний человека Петрозаводск, , V, VII конференциях НОЦ КГУ Материалы и технологии XXI века Казань, ,, а также на итоговых конференциях КГУ . Публикации. По теме диссертации опубликовано научных работ. Структура и объем диссертации. Работа изложена на 5 страницах, содержит 8 таблиц и рисунка и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов исследований, обсуждения результатов, выводов и списка литературы, включающего 1 источник, из них 5 на иностранном языке. Оксид азота является одним из важнейших биологических медиаторов, который вовлечен во множество физиологических и патофизиологических процессов. Он участвует в реализации таких функций, как вазодилатация, нейротрансмиссия, снижение агрегации тромбоцитов, регуляция тонуса гладких мышц, состояние памяти и др. Наряду с регуляторными функциями 0 обнаруживает также цитотоксическуюцитостатическую активность, выступая в качестве одного из основных эффекторов системы клеточного иммунитета. Функциональная активность 0 обеспечивается его генерацией из Ьаргинина, катализируемой ферментом Юсинтазой  АМеПоп е а1, . В отличие от млекопитающих, у прокариот возможны два пути образования оксида азота. Первым и основным является процесс диссимиляционной нитратредукции денитрификации. 0 образуется в результате восстановления нитрита Ж2 при участии фермента нитритредуктаза и, согласно общепринятым представлениям, является обязательным свободным интермедиатом денитрификации у большинства способных к ней микроорганизмов 2шпй, . Второй обнаруженный у бактерий путь образования 0 аналогичен таковому у млекопитающих и представляет собой катализируемое ферментом ЫОсинтаза  окисление Ьаргинина до цитруллина и 0 СШгогго1а, . Основным известным источником оксида азота в мире прокариот считается процесс денитрификации. Денитрификацией называется энергодающий процесс восстановления оксоанионов Жз и Ж2 до какойлибо из газообразных форм азота 0, , 2. Следует различать ассимиляционную нитратредукцию, в ходе которой азот нитрата используется бактериями для синтеза азотсодержащих клеточных компонентов, и диссимиляционную нитратредукцию или денитрификацию, когда нитрат в анаэробных условиях служит конечным акцептором электронов ритЙ, .