Хроматографический и масс-спектрометрический анализ модифицированных аналогов генно-инженерного инсулина человека

СОДЕРЖАНИЕ
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ 
ВВЕДЕНИЕ.
1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР  
1.1 Основные виды анатидиабетических средств
1.1.1. Инсулин. Общая характеристика 
1.1.1.1. Строение инсулина
1.1.1.2. Способы получения
1.1.1.3. Физикохимические свойства инсулина 
1.1.1.4. Лекарственные препараты 
1.1.2. Модифицированные аналоги инсулина
1.1.2.1. Инсулиноподобные аналоги 
1.1.2.2. Химически модифицированные инсулины
1.1.2.2.1. Пэгилированные инсулины 
1.1.2.2.2. Гликозилированные инсулины    
1.1.2.2.3. Ацилированные инсулины 
1.2. Методы исследования и анализа инсулина и
его модофицированных аналогов.
1.2.1. Методы разделения и определения места присоединения модифицирующего агента 
1.2.2. Методы определения первичной структуры инсулина и его аналогов 
1.2.2.1. Определение Иконцевых аминокислот и последовательностей 
1.2.2.2. Опеделение Сконцевых аминокислот 
1.2.2.3. Массспектрометрическое секвенирование
2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.
2.1. Реактивы и материалы 
2.2. Приготовление рабочих растворов 
2.3. Приборы и оборудование 
 
      
  
 
 
 
 
 
 
 
2.4. Общая методология работы       
2.4.1. Анализ инсулина, дисахаридилинсулина и ПСАинсулина методами ОФ ВЭЖХ и массспектрометрии     
2.4.2. Анализ инсулина, ЬуБРгоинсулина и Аринсулина методами ОФ ВЭЖХ и массспектрометрии     
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ..
3.1. Химически модифицированные инсулины     
3.1.1. Анализ дисахаридилинсулина       
3.1.2. Анализ полисиалированного инсулина     
3.2. Инсулиноподобные аналоги       
ВЫВОДЫ  
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


В настоящее время для терапии диабета 1ого типа чаще всего используют генноинженерный инсулин человека ГИИЧ. Крупномасштабное производство и поставки этого препарата в нашу страну осуществляет ряд крупных иностранных фирм. В России его производство началось в Институте биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова ИБХ РАИ. К сожалению, ГИИЧ не всегда идеально регулирует уровень глюкозы в организме человека. Кроме того, его применение сопровождается рядом негативных явлений, включая протеолиз в потоке циркулирующей крови, преждевременное выведение, иммуногенноегь, небольшое время действия и т. По этой причине, наряду с производством рекомбинатного инсулина, идут разработки и внедрение в практику его модифицированных аналогов, которые отличались бы меньшей токсичностью и тем же самым, как минимум, или лучшим терапевтическим эффектом. Модифицированные аналоги инсулина получают, используя два основных подхода. В одном случае проводят изменение первичной структуры полипептидной цепи ГИИЧ, удаляя определенный е фрагмент или изменяя часть аминокислотной последовательности. В другом случае проводят химическую модификацию ГИИЧ, введением дополнительной боковой группы, используя для этого ряд соединений сахара, полиэтиленгликоль, органические кислоты и т. Целью таких модификаций является получение производных инсулина человека, обладающих большей устойчивостью к гидролизу в организме человека и меньшими побочными эффектами, присущими инсулинам предыдущих технологических поколений. В ходе разработки указанных новых препаратов возникает ряд проблем, связанных с их синтезом, контролем качества, биодеградацией, определением их структуры. Решение данных проблем позволило бы найти эффективные пути совершенствования их качества и производства. В настоящее время не существует типовой универсальной схемы анализа инсулинов данного типа, позволяющей их объективно сопоставить с ГИИЧ. Актуальность темы данной диссертации заключается в разработке, с одной стороны, общей аналитической методологии, а с другой, конкретных методик определения строения новых производных инсулина человека, перспективных в качестве новых отечественных антидиабетических лекарств. Разработка таких отечественных препаратов позволила бы, вопервых, создать инсулины нового поколения с улучшенными терапевтическими свойствами, вовторых, обеспечить пациентов необходимыми им лекарствами, втретьих, уменьшить зависимость от импортных поставок, т. России. В данной работе исследован ряд модифицированных аналогов инсулина, имеющих как неизмененные, гак и измененные инсулиновые цепи. ГИИЧ. На их основе возможно создание ингаляционных лекарственных форм. Нель работы заключается в разработке общих принципов и методологии изучения и анализа химически модифицированного ГИИЧ дисахаридилинсулина, ПСАинсулина и инсулинонодобных аналогов с измененными инсулиновыми цепями инсулинааспарта и инсулинлизпро, аналитическом обеспечения разработки с применением комплекса отечественного оборудования. Научная новизна. Разработана типовая схема анализа химически модифицированных ГИИЧ с применением пептидного картирования, ВЭЖХ, Е и МАЬГ1МС. ВЭЖХ, МСсеквенирование. Установлена структура гликозилированных инсулинов ПСАинсулина, дисахаридилинсулина, определены точки модификации полипептидных цепей ГИИЧ этими сахаридами. Практическая значимость заключается в создании аналитического обеспечения процесса разработки модифицированных инсулинов с применением комплекса отечественного оборудования. Необходимость такого вида исследований обусловлена практической потребностью разработки и их внедрения в практику. Гликозилированные полипептиды представляют интерес как новые терапевтические средства. Методики разделения и определения структуры цистеинсодержащих пептидов являются универсальными и могут быть применены как для изучения инвертированных аналогов инсулина и образующихся в ходе получения ГИИЧ родственных инсулиноподобных примесей нормируемых фармакопейной статьей, так и для анализа любых двухцепочечных цистеинсодержащих пептидов. ГИИЧ .