Биоаффинный метод на основе ДНК для изучения функционирования, взаимодействия с эффекторами и определения в многокомпонентных системах биологически активных веществ

1. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ДНК С НИЗКО И ВЫСОКОМОЛЕКУЛЯРНЫМИ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫМИ ВЕЩЕСТВАМИ И ЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКИЕ БИОАФФИНЫЕ МЕТОДЫ ИХ ОПРЕДЕЛЕНИЯ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ДНК Литературный обзор 
1.1. Взаимодействие ДНК с низкомолекулярными эффекторами ионами металлов и их комплексами 
1.1.1. Влияние переходных металлов на ДНК и функционирование организма 
1.1.2. Взаимодействие ДНК с платиновыми металлами. Противоопухолевая активность комплексов металлов платиновой
группы. 
1.2. Взаимодействие ДНК с высокомолекулярными эффекторами белками и антителами. Биоаффинные методы определения антител к ДНК 
1.3. Электрохимические методы изучения взаимодействия ДНК с тяжелыми металлами 
Электрохимические биосенсоры на основе нуклеиновых кислот и биоаффинные методы определения ДНК и ее эффекторов с их использованием
Иммобилизация нуклеиновых кислот и их фрагментов Аналитические возможности электрохимических биосенсоров на основе нуклеиновых кислот АППАРАТУРА, ОБЪЕКТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И УСЛОВИЯ ПРОВЕДЕНИЯ ЭКСПЕРИМЕНТА Объекты исследования и приготовление растворов Приборы и техника измерений
Получение биосенсорной части аффинных биосенсоров Иммобилизация ДНК Иммобилизация олигонуклеотидов Иммобилизация холинэстеразы
Изготовление биосенсорной части иммуноферментного сенсора
Получение конъюгатов фосфорорганическое соединение ДНК
Конъюгат бисоксиметилфосфиновой кислоты с дДНК Конъюгат хлорофос дДНК Получение антител к аймалину
Обработка данных по комплексообразованию металл ДНК
2.7 Построение изотерм адсорбции ионов тяжелых металлов с
помощью амперометрического ДНКсодержащего биосенсора 
3. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ДНК С НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНЫМИ
ЭФФЕКТОРАМИ ТЯЖЕЛЫМИ МЕТАЛЛАМИ. ИЗУЧЕНИЕ ИХ КОМПЛЕКСООБРАЗОВАНИЯ С РАЗЛИЧНЫМИ ФОРМАМИ ДНК И БИОАФФИННОЙ СОРБЦИИ НА ДНКСОДЕРЖАЩЕЙ МЕМБРАНЕ 
3.1. Комплексообразование тяжелых металлов с различными
формами ДНК 
3.2. Биоаффинная сорбция тяжелых металлов на ДНК
содержащей мембране 
3.3. Определение констант связывания ионов тяжелых металлов
с иммобилизованной денатурированной ДНК 
4. РАЗРАБОТКА БИОАФФИННЫХ МЕТОДОВ НА ОСНОВЕ
АМПЕРОМЕТРИЧЕСКИХ ДНКСОДЕРЖАЩИХ БИОСЕНСОРОВ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНЫХ ЭФФЕКТОРОВ ДНК 
4.1. Разработка способа иммобилизации ДНК 
4.2. Метод определения ионов тяжелых металлов с помощью амперометрического биосенсора, содержащего денатурированную ДНК, с использованием комплсксообразования в системе металлкомплексон III 
4.3. Метод определения комплексов Р1 и РУ на основе амперометрического биосенсора, содержащего денатурированную ДНК 
4.4. Метод определения аймалина с помощью ампсромстриче
ского биосенсора, содержащего нативную ДНК 
5. БИОАФФИННЫЕ МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВЫСОКО
МОЛЕКУЛЯРНЫХ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ ПРИМЕНЕНИЕ РАЗРАБОТАННЫХ АФФИННЫХ АМПЕРОМЕТРИЧЕСКИХ БИОСЕНСОРОВ В ИММУНОАНАЛИЗЕ И В КОЛИЧЕСТВЕННОЙ ОЦЕНКЕ ЕГО СПЕЦИФИЧНОСТИ 
5.1. Метод определения антител к аймалину на основе иммуноферментного анализа 
5.2. Использование разработанного амперометрического ДНКсодержащего иммуноферментного сенсора для определения антител к ДНК 
5.3. Иммуноферментный анализ с применением модуляторов ферментов и ферментного сенсора для определения антител
5.4. Аффинный амперометрический ДНКсодержащий биосснсор
в иммуноанализе антител к ДНК 
5.5. Константы связывания биоспецифического взаимодействия
ДНК аутоантитела 
6. БИОАФФИНЫЕ МЕТОДЫ НА ОСНОВЕ АМПЕРОМЕТРИЧЕСКОГО ИММУНОСЕНСОРА И ДНКЗОНДА ОПРЕДЕЛЕНИЯ ДНК И ЕЕ ФРАГМЕНТОВ И НА ОСНОВЕ ИММУНОФЕРМЕНТНЫХ ТЕСТСИСТЕМ СО СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕСКОЙ И ВИЗУАЛЬНОЙ РЕГИСТРАЦИЕЙ АНАЛИТИЧЕСКОГО СИГНАЛА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ НИЗКО И ВЫСОКОМОЛЕКУЛЯРНЫХ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ 
6.1. Иммуносенсор для определения денатурированной ДНК
ДНКзонд для определения последовательности нуклеотидов
в процессе гибридизации 
6.2. Иммуноферментные тестсистемы для определения аймали
на и антител к ДНК 
6.3. Сравнительная характеристика разработанных биоаффинных методов определения антител к ДНК 
7. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ БИОАФФИННЫХ МЕТОДОВ НА ОС
НОВЕ ДНК ДЛЯ АНАЛИЗА РЕАЛЬНЫХ ОБЪЕКТОВ
7.1. Методы на основе амперометрических ДНКсодержащих биосенсоров и спектрофотометрической тестсистемы для определения низкомолекулярных эффекторов ДНК тяжелых металлов и противоопухолевых препаратов
7.1.1. Тяжелые металлы в пищевых, экологических и биологических объектах
7.1.2. Платиносодержащие противоопухолевые препараты в сыворотке крови
7.1.3. Аймалин в сыворотке крови и фармпрепаратах
7.2. Методы на основе амперометрических биосенсоров и спектрофотометрической тестсистемы для определения высокомолекулярных эффекторов ДНК аутоаитител и диагностики аутоиммунных заболеваний
7.2.1. Диагностика алеутской болезни норок с помощью амперометрического ДНКсодержащего иммуноферментного сенсора
7.2.2. Диагностика алеутской болезни норок с помощью биоаффинного метода на основе ингибиторного иммуноферментного анализа с участием ДНК
7.2.3. Диагностика алеутской болезни норок с помощью биоаффинного метода с использованием амперометрического ДНКсодержащего биосенсора 
7.2.4. Диагностика алеутской болезни норок с помощью биоаффинного метода с использованием иммунофсрментной тестсистемы на основе нитроцеллюлозной мембраны, модифицированной ДНК 
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 
ВЫВОДЫ 
ЛИТЕРАТУРА


Для проведения массовой диагностики аутоиммунных заболеваний разработана простая, экономичная, экспрессная биоаффинная тестсистема твердофазного ИФА на основе ДНКсодержащих нитроцеллюлозных мембран для определения аутоантител со спектрофотометрической регистрацией аналитического сигнала. Для качественной характеристики результатов диагностики разработана система ее визуальной оценки. Нитроцеллюлозные мембраны после проведения диагностики могут храниться длительное время как документальные материалы тестирования. На основе тестсистемы созданы иммуноферментные наборы для экспрессдиагностики АБН на модифицированной нитроцеллюлозной мембране в ветеринарии в условиях зверосовхозов. Бирюлинский, Раифский, Тойминский Республика Татарстан и в зверосовхозе Гамовский Приморский край, а иммуноферментные диагностикумы на основе разработанной тестсистемы были представлены на международной выставке биопрепаратов г. Новый аффинный амперометрический ДНКзонд на основе олигонуклеотидов использован для высокоспецифичного и чувствительного определения ДНК и последовательности ее нуклеотидов и апробирован в Лаборатории биофизической химии и молекулярной онкологии Института биофизики АН Чешской Республики г. Брно. Состав биосенсорной части иммуноферментного сенсора, его использование в иммунодиагностике и способ медиаторного определения антител в сыворотке крови защищены авторскими свидетельствами. Способ получения конъюгата аймалина с БСА, получение на его основе АТ к аймалину и их определение защищены патентом РФ. Теоретические и практические результаты диссертации используются при чтении курсов Основы бионеорганической химии, Химия в экологии и Техногенные системы и экологический риск на химическом факультете Казанского гос. ДНК как универсального элемента биохимического распознавания и аналитического биоспецифического реагента для определения и изучения биологически активных веществ с использованием биосенсоров и тестсистем. Работа выполнена на кафедрах аналитической химии, биохимии и неорганической химии Казанского государственного университета. Диссертационная работа проводилась в рамках программы Министерства образования РФ по следующим направлениям Теоретические и экспериментальные исследования сложных реакционных систем на основе координационных соединений гос. Координационные соединения 3 переходных платиновых и редкоземельных металлов термодинамика и кинетика образования в различных средах, синтез, строение, свойства, направления практического использования гос. Агентства по грантам Чешской Республики фант 3 и Агентства по фантам Академии Наук Чешской Республики фант А1. Апробация работы. Краснодар, , 4,5, 6, 7, 8 , 9 i ,,,,, Нордвикерхаут, Нидерланды, , Венеция, Италия, , Дарем, Великобритания, , Коимбра, Португалия, , Бонн, Германия, , Краков, Польша, , Ii i С. Петербург, , XV, XVI, XVII Менделеевском съезде по общей и прикладной химии Минск, , Москва, , Казань, , Ii i i i ii, vi Ii i Лохборо, Великобритания, , . VIII, i IX Эдинбург, Великобритания, , Болонья, Италия, , IV, V конференции Электрохимические методы анализа ЭМА, ЭМА Москва, , , симпозиуме Проточный анализ Москва, , i i i Кардифф, Великобритания, , Ii i i i Рим, Италия, , Ii i Иерусалим, Израиль, , i i i Кишинев, Молдова, , ii III Сеул, Корея, , 5 Ii i ii i i i. Москва, , Ii I i i Лиссабон, Португалия, , II, III, IV, V Вссийской конференции по анализу объектов окружающей среды Экоаналитика , Экоаналитика , Экоаналитика , Экоаналитика Краснодар, , , , С. Прага. Чехия, , i Лювен, Бельгия, , i Вентура, США, , Ii i i Москва, , ii i ii Сегед, Венгрия, , XI, XII Варшава, Польша, , Саутгемптон, Великобритания, , 8 i Будапешт, Венгрия, , VII Ii vi x i i i Иваново, , 9 Ii i i, I Флоренция, Италия, , Поволжской региональной конференции. Физикохимические методы в координационной и аналитической химии Казань, , Ii i Пардубице, Чехия, , 8 , 9 Ii i i Базель, Швейцария, , Бостон, США, , Международной конференции. Сенсор. Сенсоры и микросистемы. Всероссийской конференции Актуальные проблемы аналит.